ICAD Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403560-ACT

DFFA codifica a subunidade alfa do fator de fragmentação do DNA (ICAD), uma chaperona e inibidora de CAD/DFFB que controla a fragmentação do DNA durante a apoptose. Em células saudáveis, a ICAD estabiliza a CAD e impede a atividade nucleásica prematura, enquanto, durante a apoptose, a clivagem da ICAD mediada pela caspase-3 libera a CAD ativa para gerar quebras internucleossomais do DNA. Esse eixo integra-se às vias de sinalização apoptótica intrínseca e extrínseca, conectando as cascatas de caspases ao desmonte da cromatina e às alterações da morfologia nuclear. A desregulação do controle DFFA/CAD tem sido associada a alterações na sensibilidade à morte celular e a fenótipos de integridade genômica relevantes para a biologia do câncer, o dano tecidual mediado pelo sistema imune e contextos de pesquisa em neurodegeneração.

ICAD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DFFA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ICAD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DFFA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DFFA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ICAD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DFFA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ICAD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ICAD em células tumorais com expressão de DFFA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.