Huntingtin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401441-ACT

O HTT codifica a huntingtina, uma grande proteína citoplasmática e nuclear que sustenta a homeostase neuronal por meio de funções no tráfego vesicular, na endocitose, na autofagia e no transporte dependente de microtúbulos. A huntingtina também influencia a regulação transcricional e a função sináptica ao coordenar redes de interações proteína–proteína e atuar como plataforma de montagem (scaffold) de complexos de sinalização. Em células humanas, o HTT contribui para vias de resposta ao estresse e de proteostase, conectando a função mitocondrial e a depuração seletiva de cargas a programas celulares de sobrevivência. A desregulação da biologia da huntingtina, incluindo alterações na proteostase e no controle transcricional, é amplamente utilizada como modelo para estudar perturbações de vias associadas à neurodegeneração.

Huntingtin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HTT sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Huntingtin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HTT em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HTT, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Huntingtin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HTT nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Huntingtin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Huntingtin em células tumorais com expressão de HTT silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.