HPA1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402215-ACT

O HPSE humano codifica a heparanase (HPA1), uma endo-β-D-glucuronidase que cliva cadeias de sulfato de heparano em proteoglicanos, remodelando a matriz extracelular e as membranas basais. Ao liberar fatores de crescimento e citocinas ligados ao sulfato de heparano, a HPA1 modula as interações célula–matriz, os gradientes de quimiocinas, a sinalização angiogênica e o tráfego de células inflamatórias, interseccionando-se com vias que controlam adesão, migração e permeabilidade tecidual. A atividade de HPSE está associada a alterações na dinâmica do microambiente tumoral, à biologia de invasão e metástase e à inflamação desregulada em múltiplos contextos de doença. Como resultado, o HPSE é amplamente utilizado como um nó mecanístico para estudar a renovação da matriz extracelular, o recrutamento de células imunes e a sinalização mediada por proteoglicanos.

HPA1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HPSE sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HPA1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HPSE em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HPSE, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HPA1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HPSE nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HPA1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HPA1 em células tumorais com expressão de HPSE silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.