HP1γ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417205-ACT

CBX3 codifica la proteina 1 dell’eterocromatina gamma (HP1γ), un fattore associato alla cromatina che si lega alla metilazione della lisina 9 dell’istone H3 e contribuisce a organizzare la struttura della cromatina di ordine superiore. HP1γ partecipa alla formazione dell’eterocromatina, alla regolazione trascrizionale, alla replicazione del DNA e alla risposta al danno del DNA attraverso interazioni con “writer”/“reader” epigenetici e con il macchinario di processamento dell’RNA. Modellando l’accessibilità della cromatina e la stabilità del genoma, CBX3 influenza la progressione del ciclo cellulare, i programmi di differenziamento e le reti di espressione genica responsiva allo stress. Un’attività deregolata di HP1γ e pattern di espressione alterati di CBX3 sono stati collegati a stati epigenetici aberranti osservati in molteplici contesti di tumori e malattie del neurosviluppo, a supporto del suo impiego come nodo meccanicistico negli studi sulla cromatina e sul mantenimento del genoma.

HP1γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CBX3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HP1γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CBX3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CBX3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HP1γ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CBX3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HP1γ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HP1γ nelle cellule tumorali con espressione di CBX3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.