HGFA Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404422-ACT

HGFAC codifica o ativador do fator de crescimento de hepatócitos (HGFA), uma serina protease secretada que converte proteoliticamente o pro-HGF em HGF ativo, controlando assim a sinalização parácrina por meio da tirosina quinase receptora MET. Ao regular vias dependentes de HGF/MET, incluindo PI3K–AKT, RAS–MAPK e programas a jusante ligados à motilidade celular, morfogênese e remodelamento da matriz extracelular, a HGFA ajuda a ajustar o reparo tecidual e a comunicação epitélio–estroma. A atividade desregulada de HGFA ou a sinalização alterada do eixo HGF/MET está associada a redes de proteases aberrantes e a mudanças no microambiente observadas na biologia do câncer e em contextos de remodelamento tecidual inflamatório. Como modulador a montante da disponibilidade de HGF, o HGFAC é frequentemente estudado em cascatas proteolíticas e na interação entre vias de sinalização que afetam fenótipos relacionados à invasão e a homeostase específica de órgãos.

HGFA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HGFAC sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HGFA O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HGFAC em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HGFAC, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HGFA. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HGFAC nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HGFA no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HGFA em células tumorais com expressão de HGFAC silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.