HFE Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403695-ACT

O HFE codifica uma proteína semelhante às do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I, que se associa à β2-microglobulina e modula as interações com o receptor de transferrina (TFRC) para regular a captação celular de ferro e a homeostase sistémica do ferro. Por meio da sua influência na sinalização da hepcidina (HAMP) e na deteção de ferro em hepatócitos e macrófagos, o HFE afeta o armazenamento em ferritina, a saturação da transferrina e as respostas ao stress oxidativo. A desregulação da função do HFE está associada a fenótipos de sobrecarga de ferro e a alterações da sinalização inflamatória e metabólica em tecidos sensíveis ao desequilíbrio redox. Em contextos de investigação, o HFE constitui um nó experimentalmente acessível para estudar vias dependentes de ferro que afetam a função mitocondrial, o metabolismo lipídico e o comportamento de células imunitárias.

HFE O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HFE sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HFE O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HFE em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HFE, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HFE. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HFE nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HFE no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HFE em células tumorais com expressão de HFE silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.