HECTD1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-431500-ACT

O gene Hectd1 do camundongo codifica a HECTD1, uma ligase E3 de ubiquitina do tipo HECT que catalisa a transferência de ubiquitina para proteínas substrato, a fim de controlar sua estabilidade, localização e o resultado da sinalização. A HECTD1 tem sido associada à regulação da proteostase, da organização do citoesqueleto e da migração celular por meio do remodelamento dependente de ubiquitina de complexos proteicos, influenciando vias de desenvolvimento e de resposta ao estresse. Em modelos murinos, alterações na função de Hectd1 foram associadas ao padrão embrionário e ao desenvolvimento do tubo neural, destacando sua relevância para mecanismos subjacentes a malformações congênitas. Como componente da via da ubiquitina, a HECTD1 também é estudada em contextos em que a ubiquitinação desregulada contribui para sinalização aberrante e para a homeostase tecidual.

HECTD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Hectd1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HECTD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Hectd1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Hectd1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HECTD1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Hectd1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HECTD1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HECTD1 em células tumorais com expressão de Hectd1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.