HEATR5B Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-412293-ACT-2

O HEATR5B humano codifica uma proteína que contém repetições HEAT, com função prevista de atuar como fator de andaime (scaffold) que organiza complexos multiproteicos e dá suporte ao tráfego intracelular e a processos ligados ao citoesqueleto. Com base nos papéis conhecidos das proteínas com repetições HEAT, espera-se que o HEATR5B influencie o transporte núcleo-citoplasmático, a dinâmica de complexos proteicos e a regulação da expressão gênica responsiva ao estresse, com efeitos a jusante sobre vias de crescimento e diferenciação celular. Alterações na atividade ou na expressão de HEATR5B podem contribuir para mecanismos patogênicos que envolvem perturbação da homeostase do transporte e sinalização aberrante, tornando-o relevante para estudos de disfunções celulares complexas em doenças humanas. A edição gênica de HEATR5B é útil para gerar modelos celulares knockout ou com marcação (tag), a fim de mapear interactomas, definir a localização subcelular e investigar fenótipos em nível de vias por meio de leituras transcriptômicas e proteômicas.

HEATR5B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de HEATR5B sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HEATR5B O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus HEATR5B em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição HEATR5B, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HEATR5B. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus HEATR5B nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HEATR5B no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HEATR5B em células tumorais com expressão de HEATR5B silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.