HBXIP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405228-ACT

LAMTOR5 codifica a HBXIP (proteína que interage com a proteína X do vírus da hepatite B), um adaptador endossomal/lisossomal mais conhecido como componente do complexo Ragulator, que ajuda a acoplar a detecção de aminoácidos à ativação do mTORC1 na superfície do lisossomo. Ao regular a sinalização responsiva a nutrientes, a HBXIP influencia o crescimento celular, a autofagia e a adaptação metabólica, e também tem sido associada ao controle da progressão do ciclo celular e de programas transcricionais. A expressão desregulada de HBXIP ou o envolvimento aberrante de suas vias tem sido associado a alterações na sinalização proliferativa e nas respostas ao estresse relatadas em múltiplos contextos relevantes para o câncer. Como resultado, LAMTOR5/HBXIP é frequentemente estudado em mecanismos que conectam centros de sinalização centrados no lisossomo ao metabolismo oncogênico, à proteostase e ao tráfego intracelular.

HBXIP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LAMTOR5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HBXIP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LAMTOR5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LAMTOR5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HBXIP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LAMTOR5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HBXIP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HBXIP em células tumorais com expressão de LAMTOR5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.