hamartin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402444-ACT

O TSC1 humano codifica a hamartina, uma proteína de ancoragem (scaffold) que forma um complexo funcional com o TSC2 (tuberina) para atuar como regulador ativador de GTPase (GAP) de RHEB e restringir a sinalização de mTORC1. Por meio desse eixo, a hamartina integra sinais de fatores de crescimento e de sensoriamento energético para controlar a síntese proteica, a autofagia, o crescimento celular e a homeostase metabólica. A ruptura do controle de mTORC1 mediado por TSC1 desregula os programas de tamanho e proliferação celular e altera as respostas ao estresse. A variação genética em TSC1 está associada à biologia relacionada ao complexo de esclerose tuberosa e é amplamente estudada em modelos de sinalização desregulada da via mTOR.

hamartin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TSC1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

hamartin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TSC1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TSC1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de hamartin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TSC1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de hamartin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via hamartin em células tumorais com expressão de TSC1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.