G_{α i-2} Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400568-ACT

GNAI2 codifica a subunidade alfa Gαi-2 da proteína G heterotrimérica humana, uma GTPase que acopla muitos GPCRs à inibição da adenilil ciclase e à redução do cAMP intracelular. Por meio da sinalização GPCR–Gi, a Gαi-2 influencia a atividade das vias MAPK e PI3K-AKT, regula a função de canais iônicos e modula quimiotaxia, secreção e dinâmica do citoesqueleto em diversos tipos celulares. Alterações na sinalização de GNAI2 têm sido investigadas no tráfego de células imunes e em respostas inflamatórias, bem como em processos oncogênicos nos quais a proliferação e a migração impulsionadas por GPCRs estão desreguladas. Sua posição central no controle de segundos mensageiros a torna um nó útil para dissecar a sinalização proximal ao receptor e o redirecionamento de vias dependente do contexto.

Gα i-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GNAI2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Gα i-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GNAI2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GNAI2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Gα i-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GNAI2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Gα i-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Gα i-2 em células tumorais com expressão de GNAI2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.