GS27 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406352-ACT

O GOSR2 humano codifica a GS27, uma SNARE do tipo Qb localizada no cis-Golgi e no compartimento intermediário RE–Golgi, que dá suporte ao ancoramento de vesículas e à fusão de membranas na via secretória inicial. Ao formar complexos com outras SNAREs, como a sintaxina 5, a BET1 e membros da família SEC22, a GS27 ajuda a manter a organização do Golgi, o tráfego de cargas e o processamento proteico por meio de ciclos de transporte dependentes de COPI/COPII. A disfunção de GOSR2 tem sido associada a fenótipos do neurodesenvolvimento e à epilepsia mioclônica progressiva, em linha com a sensibilidade dos neurônios ao estresse da via secretória e ao desequilíbrio da proteostase. Por isso, a GS27 é frequentemente estudada em contextos que incluem respostas ao estresse do RE, maturação de glicoproteínas e tráfego retrógrado do Golgi para o RE.

GS27 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GOSR2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GS27 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GOSR2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GOSR2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GS27. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GOSR2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GS27 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GS27 em células tumorais com expressão de GOSR2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.