GPR40 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401434-ACT

O FFAR1 (GPR40) humano codifica um receptor acoplado à proteína G para ácidos graxos livres de cadeia média e longa, que se acopla predominantemente a Gq/11 para estimular a sinalização da fosfolipase C, a mobilização intracelular de Ca2+ e a atividade da via PKC/MAPK a jusante. Na biologia das ilhotas pancreáticas, o GPR40 conecta a detecção de lipídios nutrientes à modulação da secreção de insulina estimulada por glicose e também contribui para a sinalização responsiva a lipídios em células enteroendócrinas e outros tipos celulares metabolicamente ativos. Alterações na atividade de FFAR1/GPR40 têm sido estudadas no contexto de estresse metabólico, incluindo obesidade e diabetes tipo 2, em que a sinalização induzida por ácidos graxos pode influenciar a comunicação cruzada endócrina e inflamatória. Como um receptor de membrana que integra sinais lipídicos a respostas transcricionais e secretórias, o FFAR1 é frequentemente utilizado para investigar a dinâmica de sinalização de GPCR, as respostas de segundos mensageiros e a regulação de vias metabólicas.

GPR40 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FFAR1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GPR40 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FFAR1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FFAR1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GPR40. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FFAR1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GPR40 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GPR40 em células tumorais com expressão de FFAR1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.