GPR34 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-405989-ACT-2

O GPR34 humano codifica um receptor acoplado à proteína G do tipo rodopsina, predominantemente associado à sinalização via Gi/o, modulando a dinâmica intracelular de AMPc e as respostas MAPK/ERK a jusante em contextos de células imunes e gliais. A responsividade relatada a ligantes, a pistas de lisofosfolipídios e a mediadores relacionados posiciona o GPR34 em redes de GPCRs sensores de lipídios que influenciam a quimiotaxia, a sinalização associada a citocinas e programas de ativação microglial. Alterações na expressão de GPR34 e mudanças regulatórias ou codificantes recorrentes têm sido associadas à desregulação imune e à biologia de neoplasias hematológicas, sustentando seu uso como um marcador molecular para investigar estados transcricionais conduzidos por GPCRs. A edição gênica ou a perturbação de GPR34 possibilita estudos mecanísticos do tráfego do receptor, do viés de sinalização dependente de ligante e de fenótipos específicos de tipo celular em modelos de neuroinflamação e de comunicação no microambiente tumoral.

GPR34 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GPR34 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GPR34 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GPR34 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GPR34, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GPR34. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GPR34 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GPR34 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GPR34 em células tumorais com expressão de GPR34 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.