GPR19 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407000-ACT

GPR19 codifica um recetor órfão acoplado à proteína G (GPCR) que é expresso em múltiplos tecidos e tem sido associado à regulação de redes de sinalização celular que moldam programas de transcrição, o estado de diferenciação e a fisiologia responsiva ao stress. Como recetor de membrana, o GPR19 está posicionado para influenciar vias acopladas a GPCR, como a sinalização cAMP/PKA e MAPK, com efeitos a jusante na expressão génica e na homeostase celular. Alterações na sinalização por GPCR têm ampla relevância para a regulação metabólica, a neurobiologia e a modulação imunitária, e mudanças na expressão de GPR19 têm sido investigadas em contextos que incluem inflamação e fenótipos associados ao cancro. A modulação dos níveis endógenos de GPR19 apoia estudos mecanísticos da dinâmica de sinalização impulsionada por recetores e do “cross-talk” entre vias em modelos celulares humanos.

GPR19 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GPR19 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GPR19 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GPR19 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GPR19, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GPR19. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GPR19 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GPR19 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GPR19 em células tumorais com expressão de GPR19 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.