GPR158 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407138-ACT

GPR158 (recettore accoppiato a proteina G 158) è un GPCR orfano di classe C, arricchito nel sistema nervoso e collegato alla regolazione dell’eccitabilità neuronale, della segnalazione sinaptica e delle risposte neuroendocrine. Viene comunemente descritto come un modulatore “tipo scaffold” delle vie dei GPCR, in grado di influenzare gli output di segnalazione legati a cAMP/PKA e i programmi trascrizionali a valle. Un’alterata espressione di GPR158 è stata associata a fenotipi neuropsichiatrici e alla segnalazione correlata allo stress, ed è stata anche studiata nel contesto della biologia tumorale e della regolazione della crescita cellulare. Queste caratteristiche rendono GPR158 un bersaglio utile per esplorare le reti di segnalazione legate ai recettori, i meccanismi di plasticità neuronale e gli adattamenti trascrizionali allo stress cellulare.

GPR158 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPR158 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR158 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPR158 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPR158, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR158. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPR158 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR158 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR158 nelle cellule tumorali con espressione di GPR158 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.