GPR105 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405954-ACT

P2RY14 codifica o recetor purinérgico humano GPR105, um GPCR que responde a açúcares de UDP extracelulares, como UDP-glicose, e se acopla à sinalização Gi/o para modular o cAMP intracelular e programas inflamatórios a jusante. A atividade do GPR105 influencia a quimiotaxia de leucócitos e a produção de citocinas, ligando a deteção de nucleótidos-açúcar à regulação da imunidade inata em compartimentos mieloides e epiteliais. Este recetor interseta-se com redes de sinalização de quimiocinas e purinérgica que moldam a inflamação dos tecidos e as respostas de barreira. Alterações na sinalização P2RY14/GPR105 têm sido associadas a desregulação imunitária e fisiopatologia relacionada com inflamação, tornando-o relevante para estudos mecanísticos de processos de doença impulsionados pelo microambiente.

GPR105 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de P2RY14 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GPR105 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus P2RY14 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição P2RY14, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GPR105. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus P2RY14 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GPR105 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GPR105 em células tumorais com expressão de P2RY14 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.