GPAM Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403961-ACT

A GPAM humana (glicerol-3-fosfato aciltransferase, mitocondrial) catalisa a etapa inicial e limitante da velocidade na síntese de glicerolipídios de novo, convertendo glicerol-3-fosfato e acil-CoA de cadeia longa em ácido lisofosfatídico. Essa atividade enzimática conecta o manejo mitocondrial de lipídios à produção de ácido fosfatídico, à montagem de triacilgliceróis e a uma remodelação mais ampla de fosfolipídios, influenciando assim a biogênese de membranas e a formação de gotículas lipídicas. A GPAM atua na interseção entre a utilização de ácidos graxos e a homeostase energética, com impactos a jusante sobre lipídios sinalizadores e o equilíbrio das redes metabólicas. Alterações na expressão ou na atividade de GPAM têm sido associadas a fenótipos de metabolismo lipídico desregulado, relevantes para esteatose hepática, resistência à insulina e vias de risco cardiometabólico, tornando-a um ponto útil para estudos mecanísticos em biologia metabólica.

GPAM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GPAM sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GPAM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GPAM em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GPAM, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GPAM. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GPAM nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GPAM no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GPAM em células tumorais com expressão de GPAM silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.