Glucosidase IIα Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420442-ACT

Ganab codifica a subunidade alfa da glicosidase II, uma enzima-chave do retículo endoplasmático (RE) no processamento de glicanos N-ligados, que remove de forma sequencial resíduos de glicose de glicoproteínas recém-sintetizadas. Essa atividade é essencial para o controle de qualidade no RE, sustentando o ciclo de dobramento mediado por calnexina/calreticulina, a maturação de glicoproteínas e a degradação associada ao RE (ERAD) de proteínas clientes mal dobradas. Ao moldar a proteostase, a GANAB influencia o fluxo da via secretória e programas adaptativos ao estresse, como a resposta a proteínas mal dobradas (UPR). A interrupção ou desregulação de vias de processamento de glicoproteínas ligadas à GANAB tem sido associada a fenótipos de mau dobramento proteico e a aspectos relevantes para doenças em tecidos com alta demanda secretória.

Glucosidase IIα O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ganab sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Glucosidase IIα O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ganab em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ganab, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Glucosidase IIα. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ganab nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Glucosidase IIα no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Glucosidase IIα em células tumorais com expressão de Ganab silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.