GLT25D2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405276-ACT

COLGALT2 codifica a GLT25D2, uma galactosiltransferase de colágeno beta(1‑O) que inicia a glicosilação de resíduos de hidroxilisina no colágeno ao adicionar galactose, um pré-requisito para a glucosilação subsequente e para a maturação adequada da matriz extracelular. Essa modificação pós-traducional influencia o dobramento do colágeno, sua secreção, a fibrilogênese e a organização da matriz, vinculando a atividade da GLT25D2 à proteostase na via secretória e à remodelação da matriz específica de cada tecido. Alterações na glicosilação do colágeno são relevantes para estudos de fibrose, integridade do tecido conjuntivo, dinâmica do estroma associado a tumores e biologia musculoesquelética, em que a composição da matriz extracelular modula a sinalização e a mecânica. Assim, a GLT25D2 é um alvo útil para investigar como o processamento do colágeno afeta as interações célula–matriz, a adesão e vias a jusante responsivas à arquitetura da matriz.

GLT25D2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de COLGALT2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GLT25D2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus COLGALT2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição COLGALT2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GLT25D2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus COLGALT2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GLT25D2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GLT25D2 em células tumorais com expressão de COLGALT2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.