Plasmide CRISPR d'Activation (m) GDF-11: sc-420524-ACT

Le facteur de différenciation de croissance 11 (Gdf11) code la protéine GDF-11, un ligand sécrété de la superfamille du TGF-β qui transmet son signal via les récepteurs de type II de l’activine et les kinases ALK4/5, afin d’activer des programmes transcriptionnels dépendants de SMAD2/3. Dans les tissus murins, GDF-11 contribue à l’organisation embryonnaire et, après la naissance, à la régulation de la dynamique des cellules progénitrices, en influençant la myogenèse, la neurogenèse et le développement du squelette par un contrôle de la différenciation et de la prolifération dépendant du contexte. Cette voie s’articule avec le remodelage de la matrice extracellulaire et la régulation du cycle cellulaire, ce qui fait de Gdf11 un nœud pertinent pour étudier la temporalité du développement et l’homéostasie tissulaire. Une signalisation TGF-β/activine dérégulée impliquant GDF-11 a été examinée dans des modèles de fonte musculaire, de fibrose et de déclin fonctionnel lié à l’âge, étayant des études mécanistiques sur l’équilibre des voies de signalisation plutôt que sur un sauvetage phénotypique.

GDF-11 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Gdf11 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GDF-11 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Gdf11 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Gdf11, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GDF-11. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Gdf11 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GDF-11 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GDF-11 dans les cellules tumorales présentant une expression de Gdf11 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.