GCS-β-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403225-ACT

GUCY1B3 codifica a subunidade beta 1 da guanilato ciclase solúvel (GCS-β-1), um receptor-chave para o óxido nítrico que catalisa a conversão de GTP em cGMP. Por meio da produção de cGMP, a GCS-β-1 contribui para a via de sinalização NO–sGC–cGMP, que regula o tônus vascular, a função plaquetária e o relaxamento do músculo liso por meio de efetores a jusante, como a PKG e vias mediadas por canais regulados por nucleotídeos cíclicos. Alterações na sinalização da sGC têm sido associadas à disfunção cardiovascular e da vasculatura pulmonar, a defeitos na sinalização endotelial e a processos inflamatórios. Em modelos celulares, a atividade de GUCY1B3 é comumente avaliada monitorando-se a dinâmica de cGMP, a responsividade ao NO e programas transcricionais associados ao estresse oxidativo ou nitrosativo.

GCS-β-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GUCY1B3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GCS-β-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GUCY1B3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GUCY1B3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GCS-β-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GUCY1B3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GCS-β-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GCS-β-1 em células tumorais com expressão de GUCY1B3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.