GCS-α-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404305-ACT

GUCY1A2 codifica a subunidade α2 da guanilato ciclase solúvel, um receptor heterodimérico de óxido nítrico (NO) que catalisa a conversão de GTP em cGMP. Por meio de sinalização dependente de cGMP, a GCS-α-2 contribui para a regulação do tônus do músculo liso vascular, da função plaquetária e da sinalização neuronal, integrando a produção de NO com a atividade downstream da PKG e com a renovação/degradação de cGMP controlada por fosfodiesterases. Alterações na sinalização NO–sGC–cGMP estão implicadas na fisiologia cardiovascular e metabólica e são frequentemente estudadas em contextos como disfunção endotelial, vasorreatividade comprometida e respostas inflamatórias desreguladas. A expressão de GUCY1A2 e sua estequiometria com subunidades β podem modular a sensibilidade celular ao NO e ao estresse oxidativo, tornando-a um ponto útil para dissecar a dinâmica da via do cGMP.

GCS-α-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GUCY1A2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GCS-α-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GUCY1A2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GUCY1A2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GCS-α-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GUCY1A2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GCS-α-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GCS-α-2 em células tumorais com expressão de GUCY1A2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.