GAP1-InsP₄ BP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403002-ACT

RASA3 codifica a proteína ativadora de GTPase Ras GAP1-InsP4 BP, um fator regulatório que acelera a hidrólise de GTP em pequenas GTPases da família Ras para modular a amplitude e a duração do sinal. Por responder a polifosfatos de inositol, a GAP1-InsP4 BP integra sinais de segundos mensageiros ligados a fosfoinositídeos com vias dependentes de Ras que controlam proliferação, diferenciação, dinâmica do citoesqueleto e tráfego vesicular. A atividade de RASA3 está implicada na biologia hematopoética e vascular, em que a regulação alterada de pequenas GTPases pode perturbar a função plaquetária, a sinalização endotelial e programas de desenvolvimento. A desregulação do controle da via Ras é amplamente relevante para a sinalização oncogênica e outros distúrbios caracterizados por atividade anômala das redes MAPK/PI3K, tornando RASA3 um nó útil para estudos mecanísticos de transdução de sinais.

GAP1-InsP4 BP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de RASA3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GAP1-InsP4 BP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus RASA3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição RASA3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GAP1-InsP4 BP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus RASA3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GAP1-InsP4 BP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GAP1-InsP4 BP em células tumorais com expressão de RASA3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.