GAD-65 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m2): sc-420471-ACT-2

O Gad2 de camundongo codifica a descarboxilase do glutamato 65 (GAD-65), uma enzima associada à membrana que converte L-glutamato no neurotransmissor inibitório GABA, sustentando assim a inibição sináptica e a estabilidade dos circuitos neuronais. A GAD-65 é enriquecida em interneurônios GABAérgicos e regula a síntese de GABA dependente da atividade e o suprimento vesicular de neurotransmissores nos terminais pré-sinápticos, conectando o fluxo metabólico à neurotransmissão e à plasticidade. Alterações na função de Gad2/GAD-65 são amplamente usadas como ponto de entrada molecular para estudar o equilíbrio entre excitação e inibição e sua relevância para epilepsia, fenótipos relacionados à ansiedade e ao estresse e transtornos do neurodesenvolvimento. A edição gênica ou modelos de camundongo engenheirados direcionados a Gad2 permitem a investigação específica por tipo celular de redes inibitórias, da identidade neuronal e do rastreamento de linhagem, além da dissecação mecanística de vias de sinalização GABAérgicas no cérebro.

GAD-65 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Gad2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GAD-65 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Gad2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Gad2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GAD-65. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Gad2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GAD-65 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GAD-65 em células tumorais com expressão de Gad2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.