G2E3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405720-ACT

O G2E3 humano codifica uma ligase de ubiquitina-proteína E3 do tipo RING, implicada na proteostase dependente de ubiquitina e no controlo do ciclo celular responsivo ao stress. Ao promover a ubiquitinação seletiva de proteínas reguladoras, o G2E3 encontra-se numa posição que lhe permite influenciar a sinalização de danos no ADN, a progressão dos checkpoints e processos relacionados com a apoptose que moldam a sobrevivência celular sob stress genotóxico ou de replicação. Alterações na regulação de redes de ligases de ubiquitina que incluem o G2E3 têm sido associadas a fenótipos de instabilidade genómica e a programas de proliferação desregulados observados em diversos contextos relevantes para a doença. Como resultado, o G2E3 é frequentemente estudado pela sua contribuição para a comunicação cruzada entre a sinalização por ubiquitina, a dinâmica do ciclo celular e as respostas transcricionais ao stress celular.

G2E3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de G2E3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

G2E3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus G2E3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição G2E3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de G2E3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus G2E3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de G2E3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via G2E3 em células tumorais com expressão de G2E3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.