FRYL Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-415428-ACT

O FRYL humano codifica uma grande proteína citoplasmática implicada na regulação da morfologia celular e da organização do citoesqueleto, com ligações descritas à polaridade e a processos dependentes de actina que moldam a migração e a arquitetura dos tecidos. O FRYL tem sido associado a programas de controlo transcricional e a redes de sinalização que coordenam crescimento e diferenciação, sugerindo funções na manutenção da homeostase celular durante o desenvolvimento e em respostas ao stress. Alterações na expressão de FRYL ou perturbações do seu contexto regulatório foram observadas em estudos genómicos e transcriptómicos de cancro e de outras perturbações complexas, motivando a investigação de como o FRYL influencia a proliferação, a invasão e a expressão génica específica de linhagem. Por ser um fator relativamente pouco estudado, o FRYL constitui um nó útil para mapear interações de regulação génica e vias acopladas ao citoesqueleto em modelos de células humanas.

FRYL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FRYL sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FRYL O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FRYL em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FRYL, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FRYL. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FRYL nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FRYL no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FRYL em células tumorais com expressão de FRYL silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.