FLG/Filaggrin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400644-ACT

FLG codifica a filagrina, uma proteína rica em histidina produzida durante a diferenciação terminal dos queratinócitos, essencial para a formação da barreira epidérmica. O processamento da profilagrina gera monómeros de filagrina que agregam os filamentos intermédios de queratina, promovem a montagem do envelope cornificado e sustentam a arquitetura do estrato córneo, ligando o FLG aos programas de queratinização e de diferenciação epidérmica. A degradação subsequente da filagrina contribui para componentes do fator hidratante natural que regulam a hidratação e o pH do estrato córneo, influenciando a atividade de proteases e a defesa inata. A perda de função ou a redução da expressão de FLG está fortemente associada à disfunção da barreira e à suscetibilidade a fenótipos cutâneos inflamatórios, tornando o FLG um alvo-chave para o estudo da homeostase epitelial e das respostas ao stresse.

FLG/Filaggrin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FLG sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FLG/Filaggrin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FLG em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FLG, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FLG/Filaggrin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FLG nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FLG/Filaggrin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FLG/Filaggrin em células tumorais com expressão de FLG silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.