FKHRL1/FOXO3a Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400308-ACT

FOXO3 (FKHRL1/FOXO3a) é um fator de transcrição da família forkhead box que integra a sinalização de insulina/IGF-1–PI3K–AKT com respostas celulares ao estresse para regular genes que controlam apoptose, parada do ciclo celular, reparo de danos ao DNA, autofagia e defesa antioxidante. A fosforilação por AKT promove a exclusão nuclear de FOXO3, enquanto o estresse oxidativo e sinais dependentes de AMPK favorecem sua atividade nuclear e programas transcricionais ligados à homeostase metabólica e à sobrevivência. FOXO3 também interage com as vias de TGF-β, MAPK e mTOR para moldar a diferenciação e as respostas imunes e inflamatórias em diferentes tipos celulares. Alterações na regulação de FOXO3 têm sido associadas à biologia tumoral, a processos neurodegenerativos, a fenótipos cardiometabólicos e a características relacionadas ao envelhecimento, tornando-o um nó comum em estudos mecanísticos de adaptação ao estresse.

FKHRL1/FOXO3a O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FOXO3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FKHRL1/FOXO3a O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FOXO3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FOXO3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FKHRL1/FOXO3a. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FOXO3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FKHRL1/FOXO3a no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FKHRL1/FOXO3a em células tumorais com expressão de FOXO3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.