FEN-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403168-ACT

O FEN1 humano codifica a endonuclease de flap 1 (FEN-1), uma nuclease específica de estrutura essencial para o processamento de intermediários de “flap” 5′ durante a maturação dos fragmentos de Okazaki e o reparo por excisão de base de patch longo. A FEN-1 coordena-se com PCNA, DNA polimerase δ/ε e DNA ligase I para manter a progressão da forquilha de replicação e a integridade do genoma, além de contribuir para a estabilidade dos telômeros e a resolução de estruturas de replicação estagnadas. A atividade ou expressão desregulada de FEN1 está associada a estresse replicativo, instabilidade cromossômica e sinalização alterada da resposta a danos no DNA, tornando-a relevante para estudos de mutagênese e defeitos de manutenção do genoma associados ao câncer. Como um nó central na replicação e no reparo do DNA, a FEN-1 é frequentemente investigada em vias que regulam checkpoints do ciclo celular, a escolha da via de reparo e mecanismos de resistência a perturbações genotóxicas.

FEN-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FEN1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FEN-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FEN1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FEN1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FEN-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FEN1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FEN-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FEN-1 em células tumorais com expressão de FEN1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.