FBXW5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404410-ACT

FBXW5 codifica um recetor de substratos contendo um domínio F-box e repetições WD no âmbito dos complexos de ligase E3 de ubiquitina do tipo SCF (SKP1–CUL1–F-box), que conferem especificidade de alvo para a degradação proteassomal mediada por ubiquitina. Ao promover a renovação regulada de proteínas envolvidas em sinalização e no ciclo celular, a FBXW5 contribui para o controlo da proteostase, a coordenação de checkpoints e a modulação de vias associadas ao crescimento e às respostas ao stress. Alterações na atividade do sistema ubiquitina–proteassoma envolvendo proteínas F-box são frequentemente associadas a proliferação desregulada e instabilidade genómica, tornando a FBXW5 um nó relevante para estudos mecanísticos em biologia do cancro e fenótipos celulares relacionados. Como gene humano, a FBXW5 é frequentemente investigada para compreender como o reconhecimento de substratos e a cinética de degradação remodelam o output das vias em contextos celulares específicos.

FBXW5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FBXW5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FBXW5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FBXW5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FBXW5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FBXW5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FBXW5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FBXW5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FBXW5 em células tumorais com expressão de FBXW5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.