FAT2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402931-ACT

O FAT2 humano codifica uma proteína atípica semelhante às caderinas, pertencente à família FAT, implicada na adesão célula–célula, na polaridade planar e na regulação da organização do citoesqueleto. A sinalização associada ao FAT2 interage com processos que moldam a arquitetura epitelial, a migração direcional e a morfogênese tecidual, conectando-o a vias que governam o estabelecimento da polaridade e a integridade das junções. Alterações na atividade da família FAT têm sido associadas ao controlo de crescimento desregulado e a fenótipos invasivos em múltiplos contextos de doença, sustentando a investigação do FAT2 em mecanobiologia e na homeostase epitelial. Assim, o FAT2 é relevante para estudos de sinalização dependente de polaridade, organização da membrana e programas transcricionais ligados à adesão.

FAT2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de FAT2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FAT2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus FAT2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição FAT2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FAT2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus FAT2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FAT2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FAT2 em células tumorais com expressão de FAT2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.