FAM195A Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-426985-ACT

Fam195a codifica a proteína murina FAM195A, um fator ainda pouco caracterizado, com ligações emergentes à sinalização intracelular e a programas celulares responsivos ao estresse, com base na arquitetura de domínios conservados e em padrões de expressão. As evidências disponíveis sugerem papéis na regulação da homeostase proteica e de processos associados à membrana, que podem influenciar o crescimento celular, a diferenciação e a adaptação a sinais metabólicos. A atividade alterada de vias que controlam a proteostase e a sinalização de estresse é amplamente relevante para fenótipos que afetam a manutenção de tecidos e funções imunes ou do neurodesenvolvimento, tornando Fam195a um locus útil para estudos mecanísticos. Como as anotações funcionais ainda são limitadas, a modulação controlada da expressão endógena de Fam195a pode ajudar a definir redes transcricionais a jusante e dependências de vias.

FAM195A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Fam195a sem alterar a sequência de ADN subjacente.

FAM195A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Fam195a em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Fam195a, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de FAM195A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Fam195a nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de FAM195A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via FAM195A em células tumorais com expressão de Fam195a silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.