EXTL1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-409470-ACT

A EXTL1 humana (glicosiltransferase 1 semelhante à exostosina) é uma enzima residente no complexo de Golgi implicada no início e no alongamento de cadeias de glicosaminoglicanos de sulfato de heparano em proteínas centrais de proteoglicanos. Ao moldar a estrutura do sulfato de heparano, a EXTL1 influencia a organização da matriz extracelular e as interações ligante–receptor que modulam a sinalização por fatores de crescimento, gradientes de morfógenos e a comunicação célula–célula. Esses processos conectam a EXTL1 a vias que regulam adesão, migração e diferenciação, nas quais alterações na biossíntese de proteoglicanos podem afetar a homeostase tecidual. A montagem desregulada do sulfato de heparano tem sido associada a anomalias do desenvolvimento e a um redirecionamento de sinalização relevante para doenças, tornando a EXTL1 um alvo útil para estudos mecanísticos de glicobiologia em células humanas.

EXTL1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EXTL1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EXTL1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EXTL1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EXTL1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EXTL1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EXTL1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EXTL1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EXTL1 em células tumorais com expressão de EXTL1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.