Exo84 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403472-ACT

O EXOC8 humano codifica a Exo84, um componente central do complexo de ancoragem exocisto, composto por oito subunidades, que direciona vesículas secretoras para locais definidos na membrana plasmática antes da fusão mediada por SNARE. Por meio de seu papel na exocitose polarizada, a Exo84 sustenta processos que incluem o estabelecimento da polaridade epitelial, o crescimento de neuritos, a ciliogênese e a migração celular direcionada, além de interagir com a sinalização de pequenas GTPases (por exemplo, as vias de Ral e Rab) que coordenam o direcionamento de vesículas e a remodelação do citoesqueleto. O tráfego dependente do exocisto também influencia a entrega à superfície e a reciclagem de receptores e transportadores, moldando as respostas de sinalização e a composição da membrana. A desregulação da função do exocisto tem sido associada a alterações da polaridade celular e a comportamento invasivo em modelos de câncer, bem como a defeitos na homeostase neuronal e epitelial ligados a fenótipos de desenvolvimento e neurodegenerativos.

Exo84 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EXOC8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Exo84 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EXOC8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EXOC8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Exo84. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EXOC8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Exo84 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Exo84 em células tumorais com expressão de EXOC8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.