ERp72 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402689-ACT

O PDIA4 humano codifica a ERp72, uma isomerase de dissulfetos proteicos do retículo endoplasmático (RE) que catalisa a troca tiol–dissulfeto para apoiar a dobragem oxidativa e o controlo de qualidade de proteínas secretórias e de membrana recém-sintetizadas. A ERp72 atua na rede de proteostase do RE em conjunto com chaperonas e outras PDIs, contribuindo para a degradação associada ao RE (ERAD) e amortecendo perturbações que desencadeiam a resposta a proteínas mal dobradas (UPR). Por meio destas atividades, o PDIA4 influencia a homeostase redox, o processamento relacionado com a apresentação de antigénios e a capacidade secretória em células altamente secretoras ou sob stress. A desregulação da proteostase do RE e da atividade de PDIs está frequentemente associada a sinalização inflamatória, stress metabólico e adaptação de células tumorais, tornando o PDIA4 um alvo útil para dissecar a biologia das respostas ao stress.

ERp72 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PDIA4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ERp72 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PDIA4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PDIA4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ERp72. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PDIA4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ERp72 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ERp72 em células tumorais com expressão de PDIA4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.