ERGIC-53 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401602-ACT

LMAN1 codifica a ERGIC-53, um recetor de carga do tipo lectina que circula entre o retículo endoplasmático e o compartimento intermédio RE–Golgi para mediar a exportação, a partir do RE, de determinadas glicoproteínas. Ao reconhecer N-glicanos ricos em manose e interagir com a maquinaria COPII, a ERGIC-53 ajuda a coordenar o tráfego da via secretora e o controlo de qualidade de proteínas recém-sintetizadas. A LMAN1 também participa na homeostase do RE e liga o processamento de glicoproteínas à dinâmica do transporte vesicular. A disrupção genética de LMAN1 tem sido associada à deficiência combinada dos fatores V e VIII, sublinhando a sua relevância para a secreção regulada e a maturação proteica na fase inicial da via secretora.

ERGIC-53 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LMAN1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ERGIC-53 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LMAN1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LMAN1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ERGIC-53. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LMAN1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ERGIC-53 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ERGIC-53 em células tumorais com expressão de LMAN1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.