ERCC1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400630-ACT

ERCC1 codifica uma endonuclease específica de estrutura que forma um heterodímero funcional com XPF (ERCC4) para executar etapas de incisão durante o reparo por excisão de nucleotídeos (NER) e para resolver ligações cruzadas intercadeias do DNA em coordenação com a via da anemia de Fanconi. Por meio dessas atividades, o ERCC1 ajuda a manter a estabilidade do genoma, favorece a recuperação das forquilhas de replicação e limita o acúmulo de lesões no DNA causadas por luz ultravioleta e agentes genotóxicos. A função ou a expressão alterada de ERCC1 está associada à capacidade reduzida de reparo do DNA, ao aumento da carga mutacional e à hipersensibilidade celular ao estresse que causa dano ao DNA. Processos de reparo dependentes de ERCC1 são, portanto, amplamente estudados em contextos como carcinogênese, manutenção do genoma relacionada ao envelhecimento e mecanismos de resistência ou susceptibilidade a danos no DNA em sistemas experimentais.

ERCC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ERCC1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ERCC1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ERCC1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ERCC1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ERCC1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ERCC1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ERCC1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ERCC1 em células tumorais com expressão de ERCC1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.