ephrin-B3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402767-ACT

EFNB3 kodiert Ephrin-B3, einen transmembranen Liganden für Eph-Rezeptor-Tyrosinkinasen, der kontaktabhängige Signalübertragung in neuralen und vaskulären Geweben vermittelt. Ephrin-B3–Eph-Interaktionen regulieren die Axonführung, die synaptische Organisation, die Zellmigration und die Grenzbildung über bidirektionale Signalwege, die GTPasen der Rho-Familie, MAPK-Kaskaden und Signalwege des Zytoskelett-Remodelings einbeziehen. Im Nervensystem trägt Ephrin-B3 zur Kontrolle des Neuritenauswachsens sowie zu Mittellinien-Repulsionsprozessen bei, die für den Aufbau neuronaler Schaltkreise und deren Plastizität wichtig sind. Eine fehlregulierte Eph/Ephrin-Signalgebung, einschließlich veränderter EFNB3-Expression, wurde in verschiedenen krankheitsrelevanten Kontexten mit abnormer Zellmotilität und invasiven Phänotypen in Verbindung gebracht, was EFNB3 als mechanistischen Knotenpunkt für Pathway-Studien nahelegt.

ephrin-B3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EFNB3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ephrin-B3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EFNB3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EFNB3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ephrin-B3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EFNB3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ephrin-B3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ephrin-B3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EFNB3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.