ephrin-A2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403672-ACT

EFNA2 codifica a efrina-A2, um ligante de membrana ancorado por glicosilfosfatidilinositol (GPI) para as tirosina-quinases receptoras Eph, que medeia sinalização dependente de contato na comunicação célula–célula. A sinalização Eph/efrina regula a orientação axonal, a montagem de circuitos neuronais, o padrão vascular, a formação de limites epiteliais e a migração celular por meio de vias que se conectam às GTPases da família Rho, à sinalização MAPK e à remodelação do citoesqueleto. Alterações na expressão de EFNA2 ou no equilíbrio de sinalização EphA–efrina-A têm sido associadas a fenótipos de adesão e motilidade desregulados, relevantes para processos do neurodesenvolvimento e para a biologia do câncer, incluindo invasão tumoral e remodelação angiogênica. Como um sinal ancorado à superfície, a efrina-A2 também é útil para estudar a sinalização bidirecional, na qual células que expressam o ligante e células que expressam o receptor desencadeiam respostas a jusante distintas.

ephrin-A2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EFNA2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ephrin-A2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EFNA2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EFNA2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ephrin-A2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EFNA2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ephrin-A2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ephrin-A2 em células tumorais com expressão de EFNA2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.