EP1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402565-ACT

PTGER1 codifica o recetor humano de prostaglandina E2 EP1, um recetor acoplado à proteína G que se acopla preferencialmente a Gq/11 para aumentar o Ca2+ intracelular e ativar a sinalização dependente de PKC. O EP1 integra sinais de prostanoides a jusante das vias da ciclo-oxigenase para regular o tónus do músculo liso, o transporte iónico epitelial e respostas neuroinflamatórias, com crosstalk adicional com MAPK e programas de transcrição dependentes de cálcio. Alterações na sinalização PTGER1/EP1 têm sido estudadas na remodelação tecidular impulsionada pela inflamação e na sensibilização à dor, e foram implicadas na regulação dependente do contexto da proliferação e migração celulares. Estas características tornam o EP1 um alvo útil para investigar redes de sinalização responsivas a PGE2 e alterações subsequentes na expressão génica em modelos de células humanas.

EP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PTGER1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PTGER1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PTGER1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EP1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PTGER1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EP1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EP1 em células tumorais com expressão de PTGER1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.