ENX-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-417028-ACT

EZH2 codifica a proteína humana ENX-1, a subunidade catalítica do Complexo Repressor Polycomb 2 (PRC2), que trimetila a histona H3 na lisina 27 (H3K27me3) para estabelecer cromatina transcricionalmente repressiva. Por meio do silenciamento mediado por Polycomb, a ENX-1 regula a especificação de linhagens, o controlo do ciclo celular e a manutenção da identidade celular ao modular a acessibilidade da cromatina e programas epigenéticos de longo alcance. A repressão dependente de EZH2 interseta-se com vias-chave que controlam proliferação e diferenciação, incluindo remodelação da cromatina e redes transcricionais do desenvolvimento. A atividade desregulada de EZH2 e paisagens alteradas de metilação de H3K27 estão frequentemente associadas a estados transcricionais oncogénicos e a remodelação epigenética relevante para doenças, sustentando a sua utilização como gene modelo em investigação sobre cancro e biologia da cromatina.

ENX-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EZH2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ENX-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EZH2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EZH2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ENX-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EZH2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ENX-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ENX-1 em células tumorais com expressão de EZH2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.