endobrevin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403438-ACT

O VAMP8 humano codifica a endobrevina, uma SNARE associada a vesículas que medeia eventos de fusão de membranas necessários para o tráfego endossomal, a exocitose regulada e a secreção de grânulos. A endobrevina participa da montagem do complexo SNARE com parceiros da membrana plasmática para controlar o acoplamento (docking) e a fusão de vesículas em células imunes, plaquetas e compartimentos epiteliais, influenciando processos como desgranulação, liberação de citocinas e secreção de mucina. Por meio dessas funções, o VAMP8 impacta vias de transporte vesicular que moldam a sinalização inflamatória, a hemostasia e a defesa do hospedeiro. Na literatura, a desregulação do tráfego dependente de VAMP8 tem sido associada a alterações na função secretora e a fenótipos inflamatórios, sustentando sua relevância para estudos mecanísticos de fusão de vesículas e da biologia de doenças associadas à secreção.

endobrevin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VAMP8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

endobrevin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VAMP8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VAMP8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de endobrevin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VAMP8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de endobrevin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via endobrevin em células tumorais com expressão de VAMP8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.