ENA-78 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405834-ACT

CXCL5 codifica o peptídeo ativador de neutrófilos derivado do epitélio 78 (ENA-78), uma quimiocina CXC que sinaliza principalmente por meio do CXCR2 para promover a quimiotaxia, a adesão e a ativação de neutrófilos. O ENA-78 contribui para cascatas de sinalização inflamatória que convergem com programas transcricionais regulados por NF-κB e MAPK, modulando o recrutamento de leucócitos e a remodelação tecidual. A expressão desregulada de CXCL5 tem sido associada a microambientes inflamatórios crônicos e a alterações na comunicação entre estroma e sistema imune em doenças nas quais a infiltração de neutrófilos e sinais angiogênicos são proeminentes. Como mediador secretado, o ENA-78 também é usado como marcador indireto (readout) da dinâmica de redes de citocinas e da sinalização parácrina em modelos celulares epiteliais, endoteliais e mieloides.

ENA-78 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CXCL5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ENA-78 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CXCL5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CXCL5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ENA-78. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CXCL5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ENA-78 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ENA-78 em células tumorais com expressão de CXCL5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.