Emt Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402628-ACT

O ITK humano codifica a quinase de células T induzível por IL-2 (IL-2–inducible T-cell kinase), uma tirosina-quinase não receptora da família Tec que acopla o engajamento do receptor de células T (TCR) à sinalização a jusante necessária para a ativação e diferenciação de linfócitos. O ITK participa de vias proximais do TCR que convergem na ativação de PLCγ1, no fluxo de cálcio, na sinalização por MAPK e em programas transcricionais que controlam a produção de citocinas e a função efetora. A atividade desregulada de ITK está associada a alterações no equilíbrio Th1/Th2, comprometimento da imunidade antiviral e linfoproliferação anormal, tornando-o relevante para estudos de homeostase imune e mecanismos de doenças inflamatórias. No contexto da proteína Emt, o ITK fornece um ponto tratável para dissecar a dinâmica da transdução de sinais em células T humanas e em linhagens hematopoéticas relacionadas.

Emt O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ITK sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Emt O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ITK em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ITK, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Emt. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ITK nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Emt no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Emt em células tumorais com expressão de ITK silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.