emerin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401048-ACT

O EMD humano codifica a emerin, uma proteína da membrana nuclear interna com domínio LEM que ancora a lâmina nuclear e acopla o núcleo às forças do citoesqueleto por meio de interações com as laminas, BAF e componentes associados ao complexo LINC. A emerin contribui para a organização do envelope nuclear, a mecanotransdução e a ancoragem da cromatina, influenciando a regulação transcricional, as respostas a danos no DNA e a progressão do ciclo celular. A perturbação da arquitetura nuclear dependente de emerin está ligada a patologia tecido‑específica em músculo estriado e nos sistemas de condução cardíaca, tornando o EMD um modelo amplamente utilizado para a biologia de doenças associadas ao envelope nuclear. Como um arcabouço na periferia nuclear, a emerin é frequentemente estudada em vias que governam a rigidez nuclear, a estabilidade do genoma e programas de expressão gênica dependentes de diferenciação.

emerin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EMD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

emerin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EMD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EMD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de emerin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EMD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de emerin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via emerin em células tumorais com expressão de EMD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.