EHD3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-404685-ACT-2

A EHD3 humana (proteína 3 contendo domínio EH) é uma ATPase da família EHD que regula a reciclagem endocítica e a tubulação de membranas, coordenando o tráfego desde os endossomos precoces até os endossomos de reciclagem e de volta à membrana plasmática. Ao interagir com efetores de Rab e parceiros associados à membrana, a EHD3 influencia a internalização e a reciclagem de receptores, a cisão de vesículas e a organização espacial de plataformas de sinalização que moldam a polaridade e a migração celular. Alterações na expressão de EHD3 têm sido associadas a programas desregulados de transporte endossomal observados na biologia do câncer e em contextos neurológicos, nos quais a reciclagem de membrana afeta a função sináptica e a homeostase celular. A edição gênica de EHD3 em modelos de células humanas possibilita estudos mecanísticos do tráfego de endossomos para a membrana, de decisões sobre o destino de receptores e das consequências de sinalização a jusante, usando técnicas de imagem, proteômica e ensaios funcionais da dinâmica vesicular.

EHD3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EHD3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EHD3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EHD3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EHD3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EHD3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EHD3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EHD3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EHD3 em células tumorais com expressão de EHD3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.