Eg5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402276-ACT

Eg5 umano (KIF11) codifica una chinesina-5, un motore dei microtubuli che guida la separazione dei centrosomi e l’assemblaggio del fuso bipolare durante la mitosi, garantendo il corretto allineamento e la segregazione dei cromosomi. La funzione di Eg5 è integrata con la dinamica dei microtubuli e con il controllo del checkpoint di assemblaggio del fuso, collegando la motilità ATP-dipendente alla corretta progressione attraverso la transizione G2/M. Un’attività di Eg5 deregolata altera l’integrità del fuso e favorisce instabilità cromosomica e aneuploidia, processi frequentemente studiati nella biologia delle patologie proliferative. In quanto regolatore mitotico centrale, Eg5 è ampiamente utilizzata per studiare il controllo del ciclo cellulare, la meccanica del fuso e le vie della stabilità genomica.

Eg5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Eg5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione , dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Eg5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Eg5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Eg5 nelle cellule tumorali con espressione di silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.