EDG-7 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404930-ACT

LPAR3 (EDG-7) codifica um receptor acoplado à proteína G para o ácido lisofosfatídico que se acopla principalmente à sinalização via Gαi/Gαq para regular a mobilização de cálcio intracelular, a remodelação do citoesqueleto dependente de Rho/ROCK e a ativação da via MAPK/ERK. Por meio dessas vias, o EDG-7 influencia a migração celular, a dinâmica de adesão, programas de proliferação e a sinalização inflamatória em diversos tipos celulares humanos. Alterações na atividade do eixo LPA–LPAR têm sido associadas a fenótipos relacionados ao câncer, fibrose e desregulação vascular e imune, tornando o LPAR3 um ponto útil para dissecar redes de sinalização de mediadores lipídicos. Assim, o EDG-7 oferece um ponto de entrada mecanístico para estudar como sinais lipídicos extracelulares reprogramam respostas transcricionais e a sinalização próxima à membrana.

EDG-7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LPAR3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EDG-7 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LPAR3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LPAR3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EDG-7. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LPAR3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EDG-7 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EDG-7 em células tumorais com expressão de LPAR3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.