EDG-4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402448-ACT

LPAR2 (EDG-4) codifica um receptor acoplado à proteína G para o ácido lisofosfatídico (LPA), que se acopla principalmente à sinalização via Gi/Gq para regular vias de segundos mensageiros que controlam a remodelação do citoesqueleto, o fluxo de cálcio e programas de transcrição. A ativação do receptor influencia as vias de sinalização Rho/ROCK, PLC/PKC, PI3K–AKT e MAPK, ligando sinais lipídicos extracelulares à migração celular, à sobrevivência e às respostas inflamatórias. Em células humanas, a atividade de LPAR2 contribui para uma regulação dependente do contexto do comportamento de células epiteliais e imunes e é frequentemente estudada em modelos de fibrose, disfunção metabólica e sinalização do microambiente associado a tumores. A desregulação da sinalização LPAR2/EDG-4 tem sido associada a fenótipos anormais de proliferação e motilidade, tornando-a relevante para a dissecação de vias em sistemas celulares pertinentes a doenças.

EDG-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LPAR2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EDG-4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LPAR2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LPAR2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EDG-4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LPAR2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EDG-4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EDG-4 em células tumorais com expressão de LPAR2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.